HH型水浴锅用于多酚氧化酶的酶学特性分析

    三相分离法是一种提取和部分纯 化桔皮 POD 的理想方法；Gagaoua 等采用三相分 离法从无花果树中纯化蛋白酶，三相分 离法是一种简单、经济、快捷的纯化蛋白酶的方法。 但目前尚鲜见关于利用三相法分离纯化滁菊 PPO 。采用三相分离法纯化 滁菊 PPO，并对其酶学特性进行分析，以期为滁菊 采后褐变的控制提供一些理论支持。L3S 型紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪 器有限公司；BSA124S-CW 型电子天平，赛多利斯 科学仪器（北京）有限公司；超声波清洗器，宁波 海曙科生超声设备有限公司；HHS-21-4 型恒温水浴锅， 上海博迅实业有限公司；TGL-16M 型高速台式冷冻 离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司； PHS-3C 型 pH 计，上海越平科学仪器有限公司。

    在加入叔丁醇后，体系会形成三相，但中间沉 淀层富含蛋白容易发生乳化现象。现考察三相分离 的静置时间对滁菊 PPO 纯化效果的影响，三相分离过程中静置时间对滁菊 PPO 回 收率和纯化倍数没有促进作用，经静置 5 ~ 80 min 后离心，中间相均可形成一层薄薄的蛋白沉淀层， 经回收后测定其酶活回收率在 79.2% ~ 87.7%之间， 纯化倍数在 3.1 ~ 4.2 倍之间。由此可见，在三相分 离纯化蛋白质过程中，在加入叔丁醇混匀后即开始 离心分离，可以缩短三相分离的时间。以邻苯二酚为底物， 其反应的最适pH值为6.50，最适反应温度为30 ℃， 底物最适浓度为 0.35 mol·L-1，底物 Km和 Vmax 分别 为 0.174 9 mol·L-1 和 961.538 5 U·min-1。滁菊 PPO 对 pH 值和温度的变化都比较敏感，在 pH 值为 9 的条件下残存酶活仅剩 24%；70 ℃加热 3 min，残 存酶活仅剩 25%，加热 10 min 残存酶活仅剩 7.29%。